Haberler

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

AP.BIO:

IST‑1 (AB)

,

IST‑1.P (LO)

,

IST‑1.P.1 (EK)

DNA'nın belirli bir hedef bölgesini büyütmek veya çok sayıda kopyasını çıkarmak için kullanılan bir teknik.

 

Anahtar noktaları:

  • Polimeraz zincirleme reaksiyonu, veya PCR, belirli bir DNA bölgesinin birçok kopyasını yapmak için kullanılan bir tekniktir. laboratuvar ortamında (organizma yerine test tüpünde).
  • PCR, termostabil DNA polimeraza dayanır, tak polimerazve DNA gerektirir primerler ilgilenilen DNA bölgesi için özel olarak tasarlanmıştır.
  • PCR'de reaksiyon, hedef bölgenin birçok kopyasının üretilmesine izin veren bir dizi sıcaklık değişikliği boyunca tekrar tekrar döngüye alınır.
  • PCR birçok araştırma ve pratik uygulamaya sahiptir. DNA klonlama, tıbbi teşhis ve DNA'nın adli analizinde rutin olarak kullanılır.

PCR nedir?

Polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR), belirli bir DNA bölgesinin birçok kopyasını (milyonlarca veya milyarlarca!) yapmak için kullanılan yaygın bir laboratuvar tekniğidir. Bu DNA bölgesi, deneycinin ilgilendiği herhangi bir şey olabilir. Örneğin, bir araştırmacının işlevini anlamak istediği bir gen veya adli bilimciler tarafından olay yeri DNA'sını şüphelilerle eşleştirmek için kullanılan bir genetik işaret olabilir.

Tipik olarak, PCR'nin amacı, hedef DNA bölgesinden analiz edilebilecek veya başka bir şekilde kullanılabilecek kadar yapmaktır. Örneğin, PCR ile amplifiye edilen DNA için gönderilebilir. sıralamatarafından görselleştirildi jel elektroforezi, veya klonlanmış sonraki deneyler için bir plazmide dönüştürülür.

PCR, moleküler biyoloji araştırmaları, tıbbi teşhis ve hatta bazı ekoloji dalları dahil olmak üzere biyoloji ve tıbbın birçok alanında kullanılmaktadır.

Taq polimeraz

Beğenmek DNA kopyalama Bir organizmada PCR, şablon olarak mevcut zincirleri kullanarak yeni DNA zincirleri oluşturan bir DNA polimeraz enzimi gerektirir. PCR'de tipik olarak kullanılan DNA polimeraz denir. tak polimeraz, izole edildiği ısıya dayanıklı bakteriden sonra (Thermus suuaticus).

T. sucul kaplıcalarda ve hidrotermal menfezlerde yaşar. DNA polimerazı çok ısıya dayanıklıdır ve en aktif 70 °\text C70°C70, °, start text, C, end text (bir insan veya E. koli DNA polimeraz işlevsiz olacaktır). Bu ısı stabilitesi, Taq polimerazı PCR için ideal hale getirir. Göreceğimiz gibi, PCR'de tekrar tekrar yüksek sıcaklık kullanılır. denatüre şablon DNA veya ipliklerini ayırın.

PCR primerleri

Diğer DNA polimerazlar gibi, tak polimeraz, ancak kendisine verilen bir DNA'yı yapabilir. astarDNA sentezi için bir başlangıç ​​noktası sağlayan kısa bir nükleotid dizisi. Bir PCR reaksiyonunda deneyci, seçtiği primerler tarafından kopyalanacak veya çoğaltılacak DNA bölgesini belirler.

PCR primerleri, genellikle yaklaşık 202020 nükleotid uzunluğunda, kısa tek zincirli DNA parçalarıdır. Her PCR reaksiyonunda iki primer kullanılır ve bunlar hedef bölgeyi (kopyalanması gereken bölge) çevreleyecek şekilde tasarlanmıştır. Yani onlara, kopyalanacak bölgenin hemen kenarlarında, şablon DNA'nın zıt ipliklerine bağlanmalarını sağlayacak diziler verilir. Primerler, tamamlayıcı baz eşleşmesi ile şablona bağlanır.

Şablon DNA'sı:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Astar 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Astar 2:

Primerler şablona bağlandığında, polimeraz tarafından uzatılabilirler ve aralarında kalan bölge kopyalanır.

[DNA ve primer yönlülüğünü gösteren daha ayrıntılı diyagram]

PCR'nin adımları

Bir PCR reaksiyonunun temel bileşenleri şunlardır: tak polimeraz, primerler, şablon DNA ve nükleotidler (DNA yapı taşları). Bileşenler, enzimin ihtiyaç duyduğu kofaktörlerle birlikte bir tüpte birleştirilir ve DNA'nın sentezlenmesine izin veren tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngülerinden geçirilir.

Temel adımlar şunlardır:

  1. denatürasyon (96 °\text C96°C96, °, start text, C, end text): DNA zincirlerini ayırmak veya denatüre etmek için reaksiyonu kuvvetlice ısıtın. Bu, bir sonraki adım için tek iplikli şablon sağlar.
  2. tavlama (555555 - 656565°\text C°C°, start text, C, end text): Primerlerin tek iplikli şablon DNA üzerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanabilmesi için reaksiyonu soğutun.
  3. Uzantı (72 °\text C72°C72, °, start text, C, end text): Reaksiyon sıcaklıklarını şu şekilde yükseltin: tak polimeraz, yeni DNA zincirlerini sentezleyerek primerleri uzatır.

Bu döngü, kopyalanan DNA bölgesinin uzunluğuna bağlı olarak genellikle 222 - 444 saat süren tipik bir PCR reaksiyonunda 252525 - 353535 kez tekrarlanır. Reaksiyon verimliyse (iyi çalışıyorsa), hedef bölge sadece bir veya birkaç kopyadan milyarlara kadar çıkabilir.

Çünkü her seferinde şablon olarak kullanılan sadece orijinal DNA değildir. Bunun yerine, bir turda yapılan yeni DNA, bir sonraki DNA sentezi turunda şablon görevi görebilir. Primerlerin birçok kopyası ve birçok molekül vardır. tak polimeraz reaksiyonda yüzer, böylece DNA moleküllerinin sayısı her döngüde kabaca iki katına çıkabilir. Bu üstel büyüme modeli aşağıdaki resimde gösterilmektedir.

PCR sonuçlarını görselleştirmek için jel elektroforezi kullanma

Bir PCR reaksiyonunun sonuçları genellikle aşağıdakiler kullanılarak görselleştirilir (görünür hale getirilir). jel elektroforeziJel elektroforezi DNA parçalarının bir elektrik akımı ile bir jel matrisinden çekildiği ve DNA parçalarını boyutlarına göre ayırdığı bir tekniktir. PCR örneğindeki parçaların boyutunun belirlenebilmesi için tipik olarak bir standart veya DNA merdiveni eklenir.

Aynı uzunluktaki DNA fragmanları, jel üzerinde bir DNA bağlayıcı boya ile boyanırsa gözle görülebilen bir “bant” oluşturur. Örneğin, bir 400400400 baz çifti (bp) fragmanı üreten bir PCR reaksiyonu, bir jel üzerinde şöyle görünecektir:

Sol şerit: 100, 200, 300, 400, 500 bp bantlı DNA merdiveni.

Sağ şerit: PCR reaksiyonunun sonucu, 400 bp'de bir bant.

Bir DNA bandı, yalnızca bir veya birkaç kopya değil, hedef DNA bölgesinin birçok kopyasını içerir. DNA mikroskobik olduğundan, gözle görmeden önce çok sayıda kopyasının mevcut olması gerekir. Bu, PCR'nin neden önemli bir araç olduğunun büyük bir parçasıdır: DNA'nın o bölgesini görebildiğimiz veya manipüle edebileceğimiz bir DNA dizisinin yeterli kopyasını üretir.

PCR uygulamaları

PCR kullanılarak, bir DNA dizisi milyonlarca veya milyarlarca kez amplifiye edilebilir ve diğer teknikler kullanılarak analiz edilecek kadar DNA kopyası üretilebilir. Örneğin, DNA jel elektroforezi ile görselleştirilebilir, sıralamaveya kısıtlama enzimleri ile sindirilir ve klonlanmış bir plazmide dönüştürülür.

PCR birçok araştırma laboratuvarında kullanılmaktadır ve ayrıca adli tıp, genetik testler ve teşhiste pratik uygulamaları vardır. Örneğin, PCR, hastaların DNA'sından (veya doğum öncesi test durumunda fetal DNA'dan) genetik bozukluklarla ilişkili genleri amplifiye etmek için kullanılır. PCR, bir hastanın vücudundaki bir bakteri veya DNA virüsünü test etmek için de kullanılabilir: eğer patojen mevcutsa, bir kan veya doku örneğinden DNA'sının bölgelerini çoğaltmak mümkün olabilir.

Örnek problem: Adli tıpta PCR

Bir adli tıp laboratuvarında çalıştığınızı varsayalım. Az önce suç mahallinde bırakılan bir saçtan DNA örneği aldınız ve üç olası şüpheliden DNA örnekleri aldınız. Sizin göreviniz, belirli bir genetik belirteci incelemek ve üç şüpheliden herhangi birinin bu belirteç için saç DNA'sı ile eşleşip eşleşmediğini görmek.

İşaretleyici iki alel veya versiyon halinde gelir. Biri tek bir tekrar içerir (aşağıdaki kahverengi bölge), diğeri ise tekrarın iki kopyasını içerir. Tekrar bölgesini çevreleyen primerlere sahip bir PCR reaksiyonunda, ilk alel bir 200200200 \text{bp}bpstart text, b, p, end text DNA parçası üretirken, ikincisi 300300300 \text{bp}bpstart text, b üretir , p, son metin DNA parçası:

Marker allel 1: tekrar bölgesini çevreleyen primerler, 200 bp'lik bir DNA fragmanını çoğaltır

Marker alel 2: tekrar bölgesini çevreleyen primerler, 300 bp'lik bir DNA fragmanını çoğaltır

Dört DNA örneğinde PCR gerçekleştirir ve sonuçları aşağıda gösterildiği gibi jel elektroforezi ile görselleştirirsiniz:

Jelin beş şeridi vardır:

Birinci şerit: 100, 200, 300, 400 ve 500 bp bantlı DNA merdiveni.

İkinci şerit: Olay yerinden alınan DNA, 200 bp bandı.

Üçüncü şerit: Şüpheli #1 DNA, 300 bp bandı.

Dördüncü şerit: Şüpheli #2 DNA, 200 ve 300 bp bantları.

Beşinci şerit: Şüpheli #3 DNA, 200 bp bandı.

Hangi şüphelinin DNA'sı bu işaretleyicideki suç mahallindeki DNA ile eşleşiyor?

1 cevap seçin:

1 cevap seçin:

(A şıkkı)

A

şüpheli 111

(B şıkkı)

B

şüpheli 222

(C şıkkı)

C

şüpheli 333

(Seçilmiş)

D

Şüphelilerin hiçbiri

[İpucu]

Cevabınıza puan veremedik. Bir şeyi boş bıraktığınız veya geçersiz bir yanıt girdiğiniz anlaşılıyor.

Kontrol etmek

PCR ve adli tıp hakkında daha fazla bilgi

Bir suç mahallinden alınan gerçek adli DNA testlerinde, teknisyenler kavramsal olarak yukarıdaki örnektekine benzer bir analiz yapacaklardır. Bununla birlikte, olay yeri DNA'sı ile şüphelilerin DNA'sı arasında bir dizi farklı işaretleyici (sadece örnekteki tek işaretleyici değil) karşılaştırılacaktır.

Ayrıca, tipik bir adli analizde kullanılan belirteçler sadece iki farklı biçimde gelmez. Bunun yerine, onlar son derece polimorfik (poli = çok, biçim = biçim). Yani, uzunlukları küçük artışlarla değişen birçok alelde gelirler.

Adli tıpta en yaygın kullanılan işaretleyici türü, kısa tandem tekrarları (STR'ler), aynı kısa nükleotid dizisinin (tipik olarak, 222 ila 555 nükleotid uzunluğunda) birçok tekrar eden kopyasından oluşur. Bir STR'nin bir aleli 202020 tekrara sahip olabilirken, bir başkası 181818'e sahip olabilir ve bir başka aleli sadece 101010^11start superscript, 1, end superscript'e sahip olabilir.

Adli bilimciler, her biri birçok alel formunda gelen birden fazla belirteci inceleyerek, bir DNA örneğinden benzersiz bir genetik "parmak izi" oluşturabilirler. 131313 işaretleyici kullanan tipik bir STR analizinde, yanlış pozitif (aynı DNA "parmak izine" sahip iki kişi) olasılığı 101010'da 111'den azdır \text{billion}billionstart text, b, i, l, l, i, o, n, end text^11start superscript, 1, end superscript!

DNA kanıtlarının suçluları mahkum etmek için kullanıldığını düşünsek de, bu, haksız yere suçlanan kişilerin aklanmasında çok önemli bir rol oynadı (bazıları uzun yıllar hapiste olanlar dahil). Adli analiz, babalık tespiti ve afet sahnelerinden insan kalıntılarını tespit etmek için de kullanılır.

[İlişkilendirme ve referanslar]

Öğrenci misin yoksa öğretmen misin?

Öğrenci öğretmen

 


Gönderim zamanı: Ocak-08-2021